摘要

  本研究以一株丁酸梭菌菌株為研究對象，以耐受性、抑菌性和粘附性三方面來衡量其益生性。從耐高溫、耐膽鹽和耐酸方面來評價(jià)其耐受性能；從對致病菌的抑制能力來判斷其抑菌性；以小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2為模型，探究其是否能定植于腸道。本研究發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌不僅對常見致病菌K88、K99、O139、O157、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有良好的抑菌效果；而且對產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株和弱毒株也有很強(qiáng)的抑制效果，抑菌率分別為89.1%和72.9%。耐受性試驗(yàn)結(jié)果也表明丁酸梭菌有很強(qiáng)的耐溫、耐酸和耐膽鹽的能力。丁酸梭菌在小腸上皮細(xì)胞上有較強(qiáng)的粘附性，粘附率為3.4%。本研究證明該株丁酸梭菌益生性能優(yōu)良，可作為畜禽用微生態(tài)制劑開發(fā)應(yīng)用。 

 

  抗生素在飼料添加劑中的廣泛使用，引發(fā)了一系列公共安全，環(huán)境保護(hù)和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量方面的問題，導(dǎo)致動(dòng)物胃腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等（謝樹貴2007）。反對在飼料中添加抗生素的呼聲越來越高，各國紛紛作出響應(yīng)。隨著農(nóng)業(yè)部194號公告的公布，我國飼料無抗時(shí)代也即將來臨。飼料中添加抗生素主要針對梭菌、葡萄球菌等革蘭氏陽性菌，對大腸桿菌沙門氏菌也有一定的效果。目前抗生素的替代品主要是酶制劑、酸化劑、微生態(tài)制劑、中草藥、植物精油、植物提取物、溶菌酶和抗菌肽等。丁酸梭菌，又名酪酸梭菌，是存在于人和畜禽腸道的一種厭氧益生菌。丁酸梭菌作為微生態(tài)制劑，它能形成內(nèi)生芽孢，具有耐高溫、耐酸、耐膽鹽、耐部分抗生素等特性（徐瑩2009）。丁酸梭菌體內(nèi)富含蛋白酶和蛋白酶及脂肪酶，還具有氨基酸載體的作用，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)大部分氨基酸，有利于促進(jìn)動(dòng)物體生長（趙旭東2011），且對腸出血性大腸桿菌、痢疾志賀菌、霍亂沙門菌等多種病原微生物有抑制作用（張樹波2002）。因此，丁酸梭菌具備抗生素促生長和抑菌作用，同時(shí)滿足益生菌制劑篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

  菌株：丁酸梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌（強(qiáng)毒株）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（弱毒株）、大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、大腸桿菌O157、大腸桿菌O139、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。
  RCM液體培養(yǎng)基：根據(jù)成品培養(yǎng)基說明書稱取所需質(zhì)量培養(yǎng)基溶蒸餾水中，調(diào)pH值至7.3±0.1，分裝15mL培養(yǎng)基于20mL厭氧管中，121℃滅菌20min。
  RCM固體培養(yǎng)基：根據(jù)成品培養(yǎng)基說明書稱取所需質(zhì)量培養(yǎng)基溶蒸餾水中，并加入1.5%瓊脂粉，調(diào)pH值至7.3±0.1，121℃滅菌20min。
  LB培養(yǎng)基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化鈉，溶于1L雙蒸水，調(diào)pH值至7.3±0.1，121℃滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基需另加15g瓊脂粉。

2 實(shí)驗(yàn)方法
 

2.1 抑菌試驗(yàn)（牛津杯法） 

  （1）指示菌：大腸桿菌K99，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌。

  （2）指示菌菌懸液的準(zhǔn)備：指示菌菌種平板劃線，37℃培養(yǎng)12h；挑取單菌落于LB肉湯培養(yǎng)基，置37℃振蕩培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)好的菌液調(diào)整到細(xì)菌數(shù)為1×10⁷ CFU/mL。此時(shí)指示菌菌懸液制備完畢。

  （3）丁酸梭菌發(fā)酵液準(zhǔn)備：菌種平板劃線，37℃厭氧培養(yǎng)24h；挑取單菌落于RCM液體培養(yǎng)基中，置37℃厭氧培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)好的丁酸梭菌發(fā)酵液置于離心機(jī)中使用8000r/min轉(zhuǎn)速離心3min，吸取上清液，使用0.22μm無菌過濾器過濾后于4℃冰箱中備用。

  （4）抑菌試驗(yàn)：取100μL 指示菌菌懸液，滴于LB平板上，涂布棒涂布均勻，直至無可見水滴，再用無菌鑷子取滅菌牛津杯，輕輕放于LB固體培養(yǎng)基表面，吸取發(fā)酵液200μL，注入到放置平穩(wěn)的牛津杯內(nèi)（小心加入，切勿滴灑牛津杯之外的培養(yǎng)基上）。再用滅菌陶瓷蓋換掉原來的玻璃平皿蓋（以吸取培養(yǎng)基在后面實(shí)驗(yàn)過程中所蒸騰出的水分）。

  （5）培養(yǎng)：將上述加有上清液的培養(yǎng)基放置4℃冰箱8h，然后再將擴(kuò)散處理完全后的平皿放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)16h-24h后，記錄抑菌圈直徑。 

  

2.2 丁酸梭菌發(fā)酵液與產(chǎn)氣莢膜梭菌共培養(yǎng)

  （1）產(chǎn)氣莢膜梭菌復(fù)蘇：菌種平板劃線，37℃厭氧培養(yǎng)24h；挑取單菌落于RCM液體培養(yǎng)基中，置37℃振蕩培養(yǎng)48h。 

  （2）將活化好的產(chǎn)氣莢膜梭菌（強(qiáng)毒株）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（弱毒株）各1mL分別接入15mL RCM液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。 

  （3）將活化好的產(chǎn)氣莢膜梭菌（強(qiáng)毒株）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（弱毒株）各1mL分別接入15mL RCM液體培養(yǎng)基中，加入1mL丁酸梭菌處理液作為實(shí)驗(yàn)組，對照組中加入1mL RCM液體培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)。在16h測產(chǎn)氣莢膜梭菌活菌數(shù)。

2.3 耐受性試驗(yàn)

  2.3.1 耐酸試驗(yàn) 

  稱取10g菌粉加入pH分別為1.5、2.5、3.5和4.5的90mL PBS緩沖液中，37℃水浴2h，同時(shí)設(shè)置對照組。吸取0.5mL菌液于4.5mL滅菌的PBS溶液中梯度稀釋，直至得到合適的濃度。涂布于RCM培養(yǎng)基，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)，得出耐受率。 

  2.3.2 耐膽鹽試驗(yàn)

  將丁酸梭菌培養(yǎng)兩代后，取1mL接種于9mL的含0%、0.1%、0.3%和0.5%膽鹽的RCM培養(yǎng)基，37℃靜置厭氧培養(yǎng)12h，將培養(yǎng)液10倍連續(xù)梯度稀釋，直至得到合適的濃度。取0.1mL涂于RCM培養(yǎng)基，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)，得出耐受率。

  2.3.3 耐高溫試驗(yàn)

  將搖好的菌液分別放入85℃水浴鍋水浴10min，90℃水浴鍋水浴5min，拿出立馬放入冷水中冷卻，同時(shí)設(shè)置對照組，吸取0.5ml菌液于4.5ml滅菌的PBS溶液中梯度稀釋，直至得到合適的濃度。涂布于RCM培養(yǎng)基，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)，得出耐受率。 

2.4 粘附性試驗(yàn)

  （1）IPEC-J2.上皮細(xì)胞的培養(yǎng)：將IPEC-J2上皮細(xì)胞維持生長于含5%胎牛血清、0.1%青霉素和0.1%鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO?氣體條件下培養(yǎng)，隔8日更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。細(xì)胞以2×10⁵個(gè)的密度接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)液成分不加抗生素，粘附試驗(yàn)前12h更換培養(yǎng)液。 

  （2）細(xì)菌培養(yǎng)：活化的丁酸梭菌轉(zhuǎn)接RCM液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24h,離心后用0.01M pH7.2 PBS緩沖液洗滌1次，然后用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋至10⁶CFU/mL的菌液待用。 

  （3）菌株粘附能力的測定：將培養(yǎng)24h的IPEC-J2上皮細(xì)胞用PBS(pH7.2)緩沖液清洗1次，每孔加入10⁶CFU/mL的丁酸梭菌1mL，37℃孵育1h，用PBS緩沖液清洗4次，去除未粘附的細(xì)菌,然后每孔加入300μL含0.05% Triton X-100的PBS緩沖液，室溫作用10min，用吸管反復(fù)吹打以分散細(xì)菌，再加入700μLPBS緩沖液以終止反應(yīng)。10倍系列稀釋后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算粘附率。

3 結(jié)果與討論

3.1 抑菌試驗(yàn)

  丁酸梭菌具有極強(qiáng)的整腸作用，可以抑制腸道中的致病菌，促進(jìn)腸道中有益菌如雙歧桿菌和乳酸菌的生長（徐瑩2009）。丁酸梭菌對常見致病菌抑菌能力結(jié)果如圖3-1所示，丁酸梭菌對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、大腸桿菌O157、大腸桿菌O139、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有很強(qiáng)的抑菌效果。

 

▲圖 3-1 丁酸梭菌對常見致病菌的抑菌效果

3.2 丁酸梭菌發(fā)酵液與產(chǎn)氣莢膜梭菌共培養(yǎng)

  丁酸梭菌發(fā)酵液與產(chǎn)氣莢膜梭菌共培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果如表3-1和圖3-2所示，丁酸梭菌發(fā)酵液對產(chǎn)氣莢膜梭菌WSSJ01和WSSJ02的抑菌率分別為89.1%和72.9%。表明丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌有很強(qiáng)的抑制效果。

表3-1 丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用

菌落數(shù)（CFU/mL）	產(chǎn)氣莢膜梭菌（WSSJ01）	產(chǎn)氣莢膜梭菌（WSSJ02）
對照組	3.4×109	5.9×109
試驗(yàn)組	3.7×108	1.6×109
抑菌率%	89.1	72.9

 

▲圖3-2 丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果

3.3 丁酸梭菌耐受性

  益生菌用于微生態(tài)制劑應(yīng)考慮其是否能順利到達(dá)腸道及是否能耐受飼料加工（劉燕2006）。由表3-2可知，丁酸梭菌80℃處理10分鐘后，存活率為95%，90℃處理5分鐘后仍為83%，表明此菌株具有良好的耐熱性能，可以耐受飼料熟化和制粒的高溫。在pH1.5、2.5、3.5和4.5的條件下處理2h，其存活率分別為98%、98%、98%和99%，表明該菌株具有良好的耐胃酸性能。豬小腸中的膽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%-0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)，而益生菌要到達(dá)并定植于豬腸道，必須對膽鹽有一定的耐受性。在0.1%、0.3%和0.5%膽鹽的條件下處理12h，其存活率分別為99%、96%和97%，幾乎不受影響，表明該菌株具有較強(qiáng)的耐膽鹽性能。耐受性試驗(yàn)證明丁酸梭菌可順利通過胃，在腸道中發(fā)揮益生作用，并可參與飼料高溫制粒。
 

表3-2 丁酸梭菌耐受性能

3.4 丁酸梭菌粘附性 

  丁酸梭菌在IPEC-J2上的粘附率為3.4%，表明其對腸上皮細(xì)胞具有較好粘附性，可在腸道順利定植生長（表3-3）。 

 

表3-3 丁酸梭菌粘附性

  在能發(fā)揮抑菌作用的條件下，抵抗pH較低的胃酸環(huán)境以及對膽汁的耐受是篩選益生菌的首要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)本菌株在很低pH值胃酸環(huán)境下，存活機(jī)率很大，有足夠多的細(xì)菌存活下來，進(jìn)而順利到達(dá)腸道，而本菌株對腸道膽鹽的耐受使其可在宿主腸道中最后順利定殖并發(fā)揮益生作用。另外，益生菌在菌液濃縮或制粒過程中，都要進(jìn)行高溫加熱處理，因此，對高溫的耐受性成為選擇益生菌菌株的另一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。本菌株會形成芽孢以抵御不良環(huán)境，且在80℃條件下10min芽孢存活率在90%以上，這為丁酸梭菌發(fā)揮益生作用提供了有利條件。因此，本株丁酸梭菌具有良好的益生性。