高溫環境是影響動物生產的重要因素，易導致動物熱應激反應，生產性能下降甚至熱休克死亡，給畜禽生產業造成巨大的經濟損失。消除和緩解動物熱應激已成為國內外普遍關注的問題。蛋雞體溫高、皮膚無汗腺、羽毛豐厚、產蛋量高、產熱較多，是遭受熱應激最敏感的群體。益生菌因其具有調節腸道菌群平衡、改善腸道通透性及增強腸道屏障，從而提高動物生產性能的功能，因而已成為緩解動物熱應激最具潛力的生物制劑之一。

  

  本研究以蛋雞熱應激為出發點，探討枯草芽孢桿菌HDRaBS1緩解蛋雞熱應激的可行性及其機制，以期為新型抗應激生物制劑的開發奠定理論基礎。

 

材料與方法

 

1.1 益生菌制劑

枯草芽孢桿菌HDRaBS1（有效活菌數100億CFU/g，專利申請號：201410340289.1），由武漢華大瑞爾科技有限公司饋贈。

1.2 試驗動物與日糧

868只280日齡健康海蘭褐商品蛋雞，湖北武漢市新洲區張店養雞場提供，試驗分組前調整雞群產蛋率相近（約80%）。所有蛋雞均飼喂自配的玉米-豆粕基礎日糧。

1.3 試劑盒

雞血清內毒素（endotoxin）、白細胞介素1（IL-1）和白細胞介素10（IL-1）檢測試劑盒，均為上海博古生物科技有限公司產品；PrimeScript反轉錄試劑盒和熒光染料SYBR，均購自大連寶生物工程有限公司。

 

1.4 試驗分組和飼養管理  

試驗選用868只280日齡健康海蘭褐商品蛋雞，隨機分成高溫組405只，益生菌組413只（添加600g枯草芽孢桿菌菌粉/1000kg），室溫組50只，每組3個重復，均飼喂玉米-豆粕基礎日糧。其中高溫組和益生菌組的蛋雞所處環境遭受高溫應激，溫度控制為33℃；而室溫組的蛋雞所處溫度控制26℃。飼喂時間為蛋雞產蛋階段，具體從280日齡開始到300日齡結束，試驗期為20d。試驗期間雞群均自由采食和飲水，每天保持16h光照(05:00-21:00)，喂料2次(08:30，17:00)。

1.5生產性能指標測定

生產性能指標包括產蛋率、平均日采食量、平均蛋質量、料蛋比、腹瀉率、破損率和死亡率。

產蛋率、破損率和平均蛋質量：定點在16:00對試驗各組收蛋計數并稱質量，計算產蛋率、破損率和平均蛋質量。

平均日采食量：記錄每天飼料實際消耗量，計算平均日采食量。

料蛋比(即飼料轉化率)：平均日采食量/平均蛋質量。

腹瀉率：腹瀉的評判標準，①不成形、液體，稀水樣判為腹瀉；②成形、軟糞判為正常。于試驗20d時，定時觀察，并統計雞群腹瀉個體，則腹瀉率（%）=某組腹瀉雞數/某組總雞數×100%。

死亡率(%)：試驗期內某組死亡雞數/試驗期內某組雞群總數×100%。

1.6 血液指標測定

血液指標包括內毒素、促炎癥因子IL-1和抗炎癥因子IL-10。飼喂試驗結束后（試驗的20d），分別從高溫組、益生菌組、室溫組隨機取9只雞（即3只/重復），分別采集血液樣品，將每個重復的3個樣品混為一樣，共計3份血液樣品。采用翅下采血的方法，每只雞采集約3~4mL，迅速裝于真空促凝管中，傾斜靜置于37℃恒溫箱1h后，4℃放置2h，4℃ 3000r/min離心15min，移液器吸取血清分裝，參照相應試劑盒說明書對內毒素和細胞因子等指標進行測定。

1.7 腸道屏障功能測定

1）物理屏障

由腸上皮細胞之間的緊密連接蛋白基因occludin、ZO-1和JAM-A組成。試驗20d，分別從高溫組、益生菌組、室溫組隨機取9只雞（即每個重復3只），分別采集盲腸組織樣品，將每個重復的3個樣品混合，共計3份樣品。采用頸靜脈放血的方法將雞處死，立即打開腹腔，迅速找到盲腸，并從距離回盲交界處3cm左右的盲腸處剪取組織約0.1g左右（每只雞采樣的相對位置保持一致），浸入預先準備的sampleprotector（防止RNA的降解）中，液氮研磨組織，吸取1mL TRIzol試劑充分裂解提取RNA。將提取的RNA用NanoDrop 2000測定濃度和純度均符合要求，進行反轉錄成cDNA，按照PrimeScriptTM RTreagentKitwith gDNA Eraser說明書完成。以cDNA為模板，GAPDH為內參，利用熒光定量PCR檢測occlu- din、ZO-1和JAM-A mRNA的表達量。熒光定量PCR的反應參數: 95℃預變性30s；95℃變性20s，60℃ 20s，72 ℃ 10s，40個循環，溶解曲線均從65℃逐步升到95 ℃。反應體系成分按照SYBR染料說明書的推薦量添加，最終體積控制在20μL。所得試驗數據均按2-△△Ct方法計算。引物設計均采用定量專用軟件PrimerExpress完成，具體引物參數見表1。

2）機械屏障方面

主要觀察盲腸形態結構并統計絨毛長度與隱窩深度，分析上皮生長因子EFG的基因表達情況。采集上述處死雞的盲腸中段組織約1cm2（每只雞采樣的相對位置保持一致），置于含甲醛為4%的福爾馬林溶液中固定，經修整、沖洗、脫水、透蠟、包埋和切片（厚度為4μm）等處理步驟后,進行常規HE染色。使用日本NikonDS-Fi1生物光學顯微鏡并結合NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統進行觀察、取圖和拍照，從每張組織切片測定10根完整絨毛的絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD），選擇5張切片計算每個組織的平均值。檢測盲腸組織中EFG mRNA的水平，處理方法同上述1)步驟一致，其引物參數見表1。

表1  熒光定量PCR引物

基因	登錄號	引物序列（5'-3')	片段大小
GAPDH	NM_204305.1	F:GGAAAGTCATCCCTGAGCTGAAT R:GGCAGGTCAGGTCAACAACA	90
occludin	NM_205128.1	F:ATCGCCTCCATCGTCTACATC R:GCTGCACATGGCCAACAAG	90
ZO-1	XM_413773.4	F:TGGGCCTCACGGACTAAAAT R:GTTTGCTCCAACAAGATAGTTTGG	118
JAM-A	EF_102433.1	F:GAAAACCAACCCGTGGACAT R:GGAAGAGCCCTTCTGGAACTT	90
FGF	NM_001001292.1	F:GCCTGATAGGAAAACATGTCATG R:ACAAAAGCAAACAGGCCCTTT	103

1.8 數據分析

試驗數據用Excel2003軟件初步處理后，再用SPSS18.0軟件進行統計分析。利用One way ANOVA、LSD進行差異顯著性檢驗和多重比較,試驗結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。柱狀圖均采用GraphPadPrism5軟件繪制完成。

結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對熱應激蛋雞生產性能的影響

蛋雞產蛋率、平均日采食量、平均蛋質量和料蛋比結果（表2）表明，與高溫組相比，益生菌組在產蛋率、日采食量和平均蛋質量方面分別提高了2.60%（P<0.05）、2.91%（P>0.05）和0.96%（P>0.05），但均沒有達到室溫組水平；料蛋比方面，各組之間差異不顯著（P>0.05）。腹瀉防治效果、雞蛋破損率和死亡率結果（表2）顯示，與高溫組相比，益生菌組的腹瀉率降低了36.70%，基本達到室溫組的水平；雞蛋破損率方面，益生菌組＜室溫組＜高溫組；死亡率方面；室溫組＜益生菌組＜高溫組。

表2  枯草芽孢桿菌對熱應激蛋雞生長性能的影響

項目	高溫組	益生菌組	室溫組
產蛋率 %	80.70±0.03a	82.80±0.03b	85.96±0.05c
平均日采食量 g	88.10±6.25a	90.66±9.49a	102.00±1.51b
平均蛋質量 g	52.18±2.62a	52.68±1.15a	58.01±1.31b
料蛋比 %	2.09±0.17	2.07±0.23	2.05±0.14
腹瀉率 %	63.02(242/384)	39.89(158/396)	34.37(11/32)
雞蛋破損率 %	0.40	0.25	0.30
死亡率 %	2.30	1.30	0.00

注：同行數據標不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）,下同。

由此可見，日糧中添加枯草芽孢桿菌能有效改善熱應激蛋雞的生產性能。

2.2 枯草芽孢桿菌對熱應激蛋雞血液指標的影響

從表3中得知，與高溫組相比，益生菌組和室溫組血清中內毒素水平分別降低37.41%（P>0.05）和58.50%（P<0.05）；IL-1水平分別降低20.98%（P<0.05）和32.66%（P<0.05）；IL-10水平分別升高41.05%（P>0.05）和312.96%（P<0.05）。

表3  枯草芽孢桿菌對熱應激蛋雞血液指標的影響

項目	高溫組	益生菌組	室溫組
內毒素（EU/mL）	1.47±0.24a	0.92±0.23ab	0.61±0.10b
白細胞介素1（pg/mL）	190.07±12.28a	150.19±12.99b	128.00±8.00b
白細胞介素10（pg/mL）	3.24±1.15a	4.57±2.04a	13.38±3.95b

結果表明，枯草芽孢桿菌可降低血清中內毒素和促炎癥因子IL-1含量，升高抗炎癥因子IL-10含量，從而能有效改善導致蛋雞熱應激的核心因子。

2.3 枯草芽孢桿菌對熱應激蛋雞腸道屏障的影響

物理屏障方面：

圖1顯示，與高溫組相比，飼喂該枯草芽孢桿菌能顯著提高盲腸組織中occludin和ZO-1mRNA表達水平，其中ZO-1的改變已顯著超過室溫組水平，但對JAM-A的表達無影響。

 

圖1  枯草芽孢桿菌對熱應激蛋雞盲腸緊密連接蛋白基因mRNA表達水平影響

綜上所述，該枯草芽孢桿菌能顯著增強熱應激蛋雞的腸道物理屏障。

 

機械屏障方面:

高溫組的腸道絨毛結構損傷較嚴重，絨毛頂端細胞脫落，發生嚴重的斷裂而導致固有層裸露的現象（圖2 A中箭頭標示）；飼喂枯草芽孢桿菌的蛋雞腸絨毛結構則相對較好，沒有出現損傷和脫落的情況（圖2 B）；而室溫下的蛋雞腸道絨毛結構完整，走勢平直、沒有破損（由圖2 C所示,箭頭標注位置）。從表4中得出，與高溫組相比，益生菌組和室溫組均顯著提高了盲腸絨毛高度和VH/CD（P<0.05），但各組處理對隱窩深度無顯著影響（P>0.05）。

圖2  枯草芽孢桿菌對熱應激蛋雞盲腸形態結構的影響

進一步檢測該益生菌對腸黏膜修復基因EGF mRNA的表達情況，結果顯示益生菌組能顯著上調盲腸組織中EGF mRNA的表達量（P<0.05，圖3）。 綜上所述，添加該枯草芽孢桿菌能顯著改善熱應激蛋雞的腸道機械屏障。

討論

  與哺乳動物相比，雞消化道較短，成年雞的消化道長約1.5m，其中大腸僅有3~4cm長。但與哺乳動物不同的是，雞有成對的盲腸，是微生物活動的最大“器官”，長約3~5cm。盲腸是雞的重要“器官”，關于益生菌對盲腸腸道菌群影響的相關機制研究已較為深入，但從盲腸方面開展益生菌緩解雞熱應激效果的研究卻是一片空白。 本文針對蛋雞盲腸，從腸道屏障功能、血液內毒素和細胞因子變化等方面對枯草芽孢桿菌HDRaBS1緩解蛋雞熱應激機制進行了深入的研究，為今后相關研究提供了理論參考。

   研究表明，蛋雞在環境溫度21~30℃時每升高1℃，其采食量下降約1.5%；在32~38℃溫度范圍內每上升1℃，采食量下降更多（約4.6%），其中超過32℃是雞生理功能趨于紊亂的溫度范圍，將產生各種非特異性應答反應（如發汗和急促喘息等），可認為其已遭受熱應激。熱應激對蛋雞的負面影響已有研究，它能使蛋雞體溫升高，產蛋率和采食量降低，這與本文的研究結果一致（高溫組VS室溫組）。然而日糧中添加枯草芽孢桿菌能有效改善熱應激蛋雞的生產性能，但是益生菌為什么能很好地緩解熱應激依然是人們關注的重點。

  熱應激能夠損傷腸道屏障，使大量的內毒素侵入腸道黏膜下層，是導致一系列有害癥狀的核心因素。有學者詳細指出，大量的內毒素穿過腸道屏障入侵血液，作用于產致熱原細胞（主要是單核-巨噬細胞），釋放出具有危害性的促炎癥因子，從而造成機體熱應激反應。促炎癥因子IL-1作用于機體下丘腦的體溫調節中樞，促使體溫升高發熱；IL- 10是一種抗炎癥因子，其含量的升高能降低炎癥級聯反應。而在本研究中，該枯草芽孢桿菌確有顯著降低IL-1和內毒素、升高IL-10的趨勢，但是益生菌是否形成腸道屏障來保護蛋雞免受內毒素和炎癥因子的危害還需要進一步證實。

  熱應激易破壞腸黏膜的完整性和形態結構，導致機體營養吸收障礙進而導致生產性能低下，而本研究中發現益生菌能顯著改善因熱應激損傷的絨毛結構。上皮生長因子（epidermalgrowthfac- tor，EGF），主要對腸黏膜的修復和再生有著重要作用，因此，益生菌促進腸絨毛結構的發育可作為機械屏障阻止毒素的入侵可能與EGF基因表達量的升高有關。緊密連接蛋白基因主要由occludin、ZO-1和JAM-A組成，其表達量的降低會增大細胞間隙的通透性。本研究發現熱應激降低了盲腸組織中occludin、ZO-1和JAM-A基因mRNA的表達量,這可能因為應激時機體中ROS自由基增多，通過一系列調控介導鈣蛋白酶，最終導致緊密連接蛋白表達的降低。然而益生菌的飼喂能上調這些基因的表達，具有鞏固緊密連接蛋白結構重建的功能，這與Zhou等的研究結果一致。

  綜上所述，日糧中添加該枯草芽孢桿菌HDRaBS1能修復腸黏膜、上調緊密連接蛋白的表達，多層次地增強熱應激蛋雞的腸道屏障功能，阻止機體內毒素入侵血液，從而降低促炎癥因子IL-1、升高抗炎癥因子IL-10含量，從根本上緩解蛋雞熱應激癥狀。